ligación de ADN es una reacción química con la ayuda de una enzima llamada ligasa. actos ligasa de unir piezas de ADN. Específicamente, la ligasa crea un enlace fosfodiéster entre una molécula de ADN, también conocido como un nucleótido, y otro nucleótido. En un sistema biológico, ADN ligasa reparaciones y pone de nuevo juntos hebras de ADN. En el laboratorio, la ligasa permite la inserción de piezas de ADN extraño en las hebras de ADN.
Instrucciones
1 Calcular la cantidad de inserto de ADN de usar. Multiplicar 2 por el número de pares de bases del inserto de ADN y luego por 50 nanogramos (ng) de la cadena de ADN. A continuación, dividir por el número de la cadena de ADN de pares de bases. Por ejemplo, si el inserto de ADN tiene 20 pares de bases, se multiplica 20 por 2 y luego por 50 ng para obtener 2,000 ng. Entonces, si la cadena de ADN tiene 100 pares de bases, divida 2.000 ng por 100 para obtener 20 ng del inserto de ADN.
2 Descongelar tampón de ligación 2X a temperatura ambiente. Añadir hebra 50 ng de ADN, inserción de ADN de 20 ng, 3 microlitros de agua estéril, 5 microlitros de tampón de ligación 2X y 3 unidades de T4 ADN ligasa a un pequeño tubo de Eppendorf.
3 Tapar el tubo Eppendorf y permitir que la reacción de ligación de proceder a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Consejos y advertencias
- Mantenga la fuente de ADN ligasa de T4 en hielo durante su uso. Permitir que la ligasa para calentar puede dañar la enzima. ADN ligasa de T4 ligasa es la más utilizada en el laboratorio, y lleva el nombre del bacteriófago T4, un virus que digiere las bacterias.
- tampón de ligación 2X es una solución de reacción que se pueden adquirir de proveedores de laboratorio. Contiene productos químicos que mantienen el pH de la reacción a un nivel aceptable.
- Un tubo de Eppendorf es un tubo de plástico 1,5 ml con tapón adjunto. Es el tubo de reacción más comúnmente usados disponibles.