El glutatión, o GSH, es un tripéptido no esencial a partir de cisteína, glutamato y glicina. Es un poderoso antioxidante que protege las células y órganos de su cuerpo de los efectos nocivos de ROS, o especies reactivas de oxígeno, que se forman a partir de oxígeno molecular como resultado de varios procesos metabólicos en el cuerpo. Los antioxidantes, como el glutatión, neutralizan los ROS y evitar que la interacción con y dañar el ADN y las proteínas en las células. La relación de la forma oxidada y reducida de GSH en su cuerpo es indicativo del estrés oxidativo relacionado con el ROS en su cuerpo.
Instrucciones
1 Dibuje aproximadamente 2 ml de sangre por punción venosa a la vena anticubetal con una aguja de mariposa de calibre 23 unida a una jeringa de 5 ml. Añadir la muestra a tubos de ensayo que contienen heparina sódica y se invierte suavemente el tubo para mezclar.
2 Recoger las células rojas de la sangre por centrifugación de la muestra a 2.500 revoluciones por minuto durante cinco minutos. Congelar y descongelar la muestra tres veces para romper las células. Centrifugar la solución de lisado de células durante 10 minutos a 12.000 rpm y 4 grados, y recoger el sobrenadante.
3 Retire la proteína de la muestra por la adición de ácido sulfosalicílico 5 por ciento y centrifugando la muestra a 12.000 rpm durante cinco minutos a 4 grados. Almacenar el sobrenadante desproteinizado a -112 grados.
4 Mezclar un agente de tiol detección, reductasa GSH, la nicotinamida adenina dinucleótido fosfato y tampón de ensayo en proporciones indicadas por el fabricante del kit para hacer la mezcla de reacción GSH. La cantidad de cada producto químico depende del número de pruebas de que la intención de llevar a cabo. Se diluye la mezcla de reacción GSH en ácido sulfosalicílico 5 por ciento para obtener concentraciones de 16, 32, 63, 125, 250 y 500 microlitros.
5 Añadir 1 a 10 microlitros de la muestra de sangre desproteinizaron en los pocillos de una microplaca. Añadir solución estándar GSH diluido en serie, que está disponible en el kit de la prueba, a cada pocillo para llevar el volumen total de cada pocillo a 10 microlitros.
6 Añadir 90 microlitros de mezcla de reacción GSH que realizó en el paso 4 para cada pocillo de la microplaca. Mezclar el reactivo sacudiendo la placa durante 30 segundos.
7 Medir la absorbancia de inmediato mediante la colocación de la placa bajo luz con longitudes de onda de 405 y 415 nanómetros. Incubar la placa durante 30 minutos. Tome lecturas de absorbancia después de cada cinco minutos durante la incubación.
8 Diluir 6 milimolar de la muestra procesada con 5 por ciento de ácido sulfosalicílico y la solución de sulfonato trifluromethane. Esto eliminará toda la reducida GSH de la solución. Añadir 1 a 10 micoliters de esta solución a los pocillos de microplacas y repita los pasos 5, 6 y 7. Esto ayudará a estimar la cantidad de GSH oxidado en la muestra.
9 Trazar las concentraciones de absorbancia y de la muestra en un gráfico para obtener la curva de GSH por tanto glutatión reducido y oxidado. Se calcula la relación entre las dos formas de GSH. Aumento de los niveles de GSH oxidativo niveles indican el estrés oxidativo y ROS.
Consejos y advertencias
- Seguir todas las instrucciones en el kit del fabricante y el manual técnico cuidadosamente.
- Tomar las precauciones necesarias, tales como guantes y gafas utilizando las muestras biológicas.
- Asegúrese de que los resultados tengan una precisión. Pequeñas variaciones en la lectura de la absorbancia GSH pueden alterar los resultados de su prueba.